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Solución de problemas de amplificación de PCR y RT-PCR
| Problema | Causa posible |
|---|---|
| Sin bandas en gel | El tiempo de extensión fue demasiado corto |
| El termociclador no estaba a la temperatura correcta | |
| Bandas extra inespecíficas en gel | Los cebadores se hibridaron con un sitio secundario en la plantilla |
| Se introdujo contaminación de ADN en cebadores o tampones |
- ¿Qué causa la falla de la PCR??
- ¿Cómo se soluciona un problema de PCR??
- ¿Qué haría si falla la amplificación por PCR de una muestra??
- ¿Qué sucede cuando agrega demasiado cebador a la PCR??
¿Qué causa la falla de la PCR??
Por lo general, lo primero que hacen los investigadores es culpar a una enzima o reactivo defectuoso cuando un experimento falla, pero con la PCR es menos probable que esto sea la causa del fracaso. Con mayor frecuencia, la causa son problemas internos más profundos, como el diseño del cebador, los parámetros del termociclador o la unión no específica a otras secuencias de plantilla.
¿Cómo se soluciona un problema de PCR??
Verifique la capacidad de longitud de amplificación de las ADN polimerasas seleccionadas. Utilice ADN polimerasas especialmente diseñadas para PCR larga. Elija ADN polimerasas con alta procesividad, que pueden amplificar objetivos largos en menos tiempo. Reducir las temperaturas de recocido y extensión para ayudar a la unión de la imprimación y a la termoestabilidad de la enzima.
¿Qué haría si falla la amplificación por PCR de una muestra??
Si una reacción de amplificación falla y sospecha que la plantilla de ADN está contaminada con un inhibidor, agregue la preparación de ADN sospechosa a una reacción de control con una plantilla de ADN y un par de cebadores que se haya amplificado bien en el pasado .
¿Qué sucede cuando agrega demasiado cebador a la PCR??
El uso de concentraciones más altas de cebadores puede tener los siguientes efectos: Si los cebadores son capaces de formar dímeros, aumentar su concentración solo da como resultado la creación de cebadores-dímeros y no mejora la amplificación del producto de PCR deseado.
